Изучение путей синтеза аскорбиновой кислоты началось с установления природы веществ, являющихся исходными при ее новообразовании.

Первые убедительные доказательства того, что аскорбиновая кислота образуется из гексоз, были получены в экспериментах С.Рай, которая показала, что у отрезанных зародышей гороха, растущих на стерильной синтетической среде, гексозосахара увеличивали содержание витамина С. Со времени первых экспериментов прошло немало лет, однако до сих пор не ясно, какие именно сахара являются исходными для синтеза АК.

К.Л. Поволоцкая, испытав различные моно- и дисахара: глюкозу, фруктозу, галактозу, лактозу, маннозу и сахарозу - показала, что все они, за исключением лактозы, используются в синтезе АК. Необходимость глюкозы для синтеза АК отмечала и К.З. Тульчинская.

Инфильтрируя в проростки овса различные соединения, В.Н. Девятнин установил, что синтез АК усиливается при введении веществ, содержащих 6 углеродных атомов и сходных по расположению отдельных атомов в положении С₅-С₆ с l-АК. Соединения, не отвечающие этим требованиям, как полагает автор, в биосинтезе АК непосредственного участия не принимают. Основным материалом для синтеза АК, по его мнению, являются углеводы, и в первую очередь такие углеводы и их производные, как инозит, сорбит, 2-кето-l-гулоновая кислота, левулоза и сорбоза.

Большое влияние на биосинтез аскорбиновой кислоты из экзогенных субстратов оказывают условия освещенности. Так, в опытах Аберга выдерживание в темноте в течение 1-5 суток листьев овса и петрушки на 2,5-5%-ных растворах сахарозы, глюкозы, фруктозы, маннозы, галактозы, ксилозы снижало в них содержание аскорбиновой кислоты и только при длительном выдерживании листьев (2-4 суток) на 10-20%-ных растворах сахарозы и 5%-ных растворах глюкозы и ксилозы в темноте наблюдалось некоторое увеличение содержания аскорбиновой кислоты по сравнению с исходным. В наших исследованиях также подчеркивается необходимость света в образовании аскорбиновой кислоты из глюкозы.

Иного характера данные приводит Е.Ассольбергс. Из большого набора исследованных им соединений (d-глюкоза, d-фруктоза, l-сорбоза, d-глюкуроновая кислота, 2-кета-l-гулоновая кислота, глюкозоциклоацетоуксусная кислота и др.) только -лактон глюкуроновой кислоты вызывал значительное увеличение содержания аскорбиновой кислоты в листьях молодых побегов яблони, находящихся на свету (18 тыс.люкс, 24,48 часов). Автор не нашел положительного действия глюкозоциклоацетоацетата на биосинтез АК, в то время как ряд исследователей рассматривал это соединение как промежуточное при биосинтезе АК. Семена фасоли при проращивании в присутствии радиоактивной глюкозы или радиоактивного глюкозоциклоацетоацетата использовали последний в пять раз лучше, чем глюкозу. М. Натх и М. Белкходе также отмечали преимущественное использование глюкозоциклоацетоацетата в биосинтезе АК по сравнению с глюкозой и ацетоацетатом.

В опытах М. Накатани ферментный препарат, выделенный из зародышей 6-дневных зеленых проростков гороха, способных интенсивно синтезировать АК, катализировал образование АК из d-глюкуроновой, d-галактуроновой и особенно из диацетон-2-кето-l-гулоновой кислот. В присутствии d-глюкозы иd-галактозы синтез АК не шел.

Использование углеводов в биосинтезе АК в настоящее время не вызывает сомнения. Что касается исследования органических кислот как субстрата для образования АК, то здесь следует снова обратиться к работе В.А. Девятнина, в которой помимо уже названных соединений изучалось действие щавелевой, винной, фумаровой, янтарной, лимонной, альгиновой, АК и 2-кета-l-гулоновой кислот. При инфильтрации в проростки овса из них лишь последняя увеличила содержание АК на 20% по сравнению с исходным. Введение АК поднимало собственный уровень лишь на 6%, фумаровой и лимонной - на 2,6. Винная и альгиновая кислоты не меняли содержание АК, щавелевая - снижала его на 15%. В опыте использовались растения, выращенные на свету.

В своей работе по изучению действия органических кислот на биосинтез АК мы строго контролировали условия освещения во время опыта. В качестве субстрата использовали -кетоглутаровую, янтарную, винную, щавелевую, яблочную и лимонную кислоты в концентрации 0,005 М. Опытные 7-9-дневные проростки ячменя, предварительно выдержанные в темноте в течение 48 часов, помещали на растворы кислот в темноте и на свету люминесцентных ламп ЛЦД-40 (17 тыс. эргсм^-2с^-1) на 6 часов. В связи с тем, что использование глюкозы в процессе биосинтеза АК является доказанным, в параллельных вариантах листья помещались на 0,005 М раствор глюкозы и на воду. Контролем служили растения, растущие во время опыта в темноте.

В таблице 1 представлены данные о действии винной кислоты на биосинтез АК в проростках ячменя. На растворе винной кислоты на свету содержание АК в листьях увеличилось в 2,5 раза по сравнению с контролем, тогда как на растворе глюкозы - общепризнанном субстрате для биосинтеза АК - в 2 раза, на воде - лишь на 38%. Положительное действие на биосинтез АК винная кислота, так же как и глюкоза, оказывала только на свету.

Таблица 1

Влияние винной кислоты на биосинтез АК в 8-9-дневных проростках ячменя (экспозиция 6 час; интенсивность света 17 тыс. эргсм^-2с^-1)

n = 6, t_табл. = 2,57 для Р 0,05

Достаточно хорошо используется в биосинтезе АК и -кетоглутаровая кислота (табл.2): содержание АК в листьях, плавающих на 0,005 М растворе -кетоглутаровой кислоты, на свету увеличилось на 47%, на растворе глюкозы - на 44. В этой серии опытов использовались проростки с более высоким исходным содержанием АК, поэтому прибавка АК в абсолютных величинах не столь высока, как в предыдущих опытах, однако и здесь достоверно показано, что -кетоглутаровая кислота используется в биосинтезе АК так же хорошо, как и глюкоза. Использование -кетоглутаровой кислоты в этом процессе идет только на свету.

Положительное действие на биосинтез АК оказала и янтарная кислота (табл.3). Содержание АК в листьях, находившихся на растворах янтарной кислоты и глюкозы, увеличилось соответственно на 51 и 58%, на воде - на 39. В данных опытах выявлено достоверное накопление АК в листьях, находившихся в темноте на растворе янтарной кислоты и на воде. Вероятно, в определенных условиях проростки содержат достаточное количество предшественника АК, что позволяет им осуществлять синтез АК и в темноте, независимо от наличия экзогенных субстратов.

В проростках ячменя, помещенных на 0,005 М раствор щавелевой кислоты на свету (табл.4), за 6 часов освещения содержание АК увеличилось на 55% по сравнения с контролем. В листьях на растворе глюкозы прибавка в содержании АК составила 56%, на воде - 32. Следовательно, щавелевая кислота наряду с винной, янтарной и -кетоглутаровой может использоваться как субстрат в биосинтезе АК.

Таблица 2

Влияние -кетоглутаровой кислоты на биосинтез АК в 8-дневныхпроростках ячменя (экспозиция 6 час; интенсивность света 17 тыс. эргсм^-2с^-1)

n = 6, t_табл. = 2,57 для Р 0,05

Таблица 3

Влияние янтарной кислоты на биосинтез АК в 8-дневных проростках ячменя (экспозиция 6 час; интенсивность света 17 тыс. эргсм^-2с^-1)

n = 6, t_табл. = 2,57 для Р 0,05

Таблица 4

Влияние щавелевой кислоты на биосинтез АК в 8-дневных проростках ячменя (экспозиция 6 час; интенсивность света 17 тыс. эргсм^-2с^-1)

n = 8, t_табл. = 2,36 для Р 0,05

Наиболее активно биосинтез АК идет в проростках, помещенных на раствор щавелевой кислоты на свету, однако щавелевая кислота может использоваться и в темноте.

Содержание АК в проростках, используемых в опытах по изучению действия яблочной кислоты на биосинтез АК, было низким (табл. 5), поэтому отмечалось резкое возрастание содержания АК в освещенных листьях, находящихся на воде и на глюкозе (на 113 и 140%). В варианте же с яблочной кислотой увеличение АК составило всего лишь 48%, т.е. меньше, чем на воде.

Таблица 5

Влияние яблочной кислоты на биосинтез аскорбиновой кислоты в 7-дневных проростках ячменя (экспозиция 6 час; интенсивность света 17 тыс. эргсм^-2с^-1)

n = 8, t_табл. = 2,36 для Р 0,05

В следующей серии опытов исследовалось действие лимонной кислоты на накопление АК (табл. 6). Здесь также отмечено резкое возрастание содержания АК в освещенных проростках, причем прибавка АК была почти одинаковой во всех вариантах: на воде - 89%, на растворе лимонной кислоты - 94%, несколько большее увеличение на растворе глюкозы - 104%. Во всех темновых вариантах прибавка АК составила 19-26%. Следовательно, в присутствии экзогенной лимонной кислоты скорость новообразования АК на свету не увеличивается по сравнению с контролем на воде, а в случае с яблочной кислотой даже уменьшается.

Таким образом, наряду с углеводами в процессе биосинтеза АК могут использоваться соединения, содержащие более короткую углеродную цепочку, в частности некоторые органические кислоты, такие, как щавелевая, янтарная, винная и -кетоглутарозая. Причем использование их идет преимущественно на свету, а в случае с винной и -кетоглутаровой кислотами - только на свету. Стимуляцию накопления АК в присутствии экзогенной щавелевой и винной кислот можно объяснить исходя на того факта, что деградация АК в растениях идет с образованием данных кислот. Следовательно, при их избытке, когда возможно ингибирование процесса деструкции молекулы АК конечными продуктами реакции, снижаются ее потери.

Таблица 6

Влияние лимонной кислоты на биосинтез аскорбиновой кислоты в 8-дневных проростках ячменя (экспозиция 6 час; интенсивность света 17 тыс. эргсм^-2с^-1)

n = 6, t_табл. = 2,57 для Р 0,05

Стимуляцию синтеза АК экзогенными субстратам вообще, и органическими кислотами в частности, нельзя интерпретировать однозначно, как непосредственное использование этих соединений при новообразовании АК. Возможно опосредованное ускорение биосинтеза АК через стимуляцию других процессов, например, ЦТК в случае с органическими кислотами - интермедиатами цикла. Это предположение проверялось в опытах по исследованию действия экзогенного пирувата, декарбоксилирование которого дает уксусную кислоту, используемую в ЦТК. Исследования показали стимуляцию синтеза АК в листьях ячменя, плавающих на 0,005 М растворе пирувата, по сравнению с вариантом, где в качестве субстрата использовался 0,005 М раствор глюкозы. Положительное действие пирувата наблюдалось только у освещенных растений. Следовательно, существует связь биосинтеза АК с функционированием ЦТК на свету.

Более достоверные и информативные данные при исследовании возможности использования в биосинтезе АК тех или иных соединений, несомненно, дает метод меченых атомов. Показано, что изолированные листья девичьего винограда пятилисточкового (Parthenocissus quinquefolia .) трансформируют меченую d-глюкозу (5-³H-1-¹⁴С-глюкозу и ³H-, ¹⁴С-глюкозу) в АК с сохранением порядка атомов С-цепочки и С-6-положения оксиметильной группы. Таким образом, метод позволяет не только однозначно решить вопрос о возможности использования конкретного субстрата в биосинтезе АК, но и дает материал для решения вопроса о путях ее биосинтеза. Подробнее эти два взаимосвязанных вопроса будут рассматриваться в следующем разделе.

Химизм биосинтеза

Установление веществ, необходимых для образования АК, является лишь первым этапом в изучении путей ее синтеза, которые до сих пор полностью не исследованы. Наиболее значительные работы в этой области выполнены двумя группами исследователей: Ф.Ишервуд, Л.Мапсон, Г.Чжень и Ф. Ловус, Р. Джанг, а в последние годы - Ф.Ловус в сотрудничестве с Я. Хелспером, К. Саито и др. уже больше внимания обращали не на биосинтез, а на метаболизм АК.

Большинство авторов наиболее вероятными предшественниками АК считают d-глюкозу и d-галактозу. Это значит, что при превращении их в l-АК гидроксильные группы у пятого углеродного атома должны быть перемещены из d, положения в l. Это может осуществиться прямой инверсией групп у С₅ или инверсией всей цепи так, что С-1 d-глюкозы станет С-6 углеродной цепи АК. Имеется несколько возможных механизмов для реализации этих изменений.

Ф.Ишервуд, Г.Чжень, Л.Мапсон считают, что превращение d-глюкозы и d-галактозы в l-АК включает инверсию всей молекулы и идет без предварительного расщепления углеродной цепи.

Биосинтез АК, по их мнению, более вероятно протекает из d-галактозы путем окисления ее в d-галактуроновую кислоту, восстановления d-галактуроновой кислоты в l-галактоновую и окисления -лактона последней в l-АК.

Приведенная схема не включает всех промежуточных соединений на пути синтеза АК. Л. Мапсон и Ф. Ишервуд более подробно анализируют превращение d-галактуроновой кислоты в l-АК растительными экстрактами. Под влиянием экстракта из проростков гороха происходит превращение производных d-галактуроновой кислоты в производные l-галактоновой кислоты и дальше в l-АК. Этот процесс in vitro осуществляется в две стадии:

1) восстановление метил-d-галактуроната в l-галактоно--лактон под влиянием фермента, локализованного в растворимой части цитоплазмы; процесс идет за счет восстановленного НАДН;

2) окисление лактона в АК, требующее присутствия ферментного компонента, заключенного в митохондриях.

Эффективность использования l-галактоно--лактона в биосинтезе АК показана и другими авторами, наблюдавшими при его введении в листовые пластинки Petroselinum crispum резкое возрастание АК, содержание которой через 190 часов достигало 12% от сухого веса.

Правильность предлагаемой схемы синтеза проверяется следующим образом: в качестве субстрата растениям дается предполагаемое промежуточное вещество и регистрируется, насколько быстро из него синтезируется АК. В том случае, когда образование АК идет из d-глюкозы, непосредственным предшественником l-АК будет l-гулоно--лактон. Возможность использования в синтезе АК d-галактуроновой кислоты и гулонолактона отрицалась Е. Ассольбергсом, который показал, что в отрезанных листьях яблони они вызывали меньший синтез АК, чем водный контроль. Автор предполагал, что промежуточное вещество между глюкуроновой и АК может быть иным, чем _лактон.

Схема биосинтеза АК, предложенная Ф. Ишервудом с сотрудниками, находит подтверждение в экспериментах с использованием экзогенных субстратов (in vivo) и ферментных препаратов (in vitro). Подкормка проростков салата, бобов и гороха l-галактоно--лактоном легко дает l-АК. Д-глюкуроно--лактон и l-гулоно--лактон также дают l-АК, но в намного меньшем количестве, чем соответствующие производные галактозы.

Ф. Ишервуд с сотрудниками первыми демонстрировали образование l-АК in vitro в экстрактах из проростков гороха, используя l-галактоно--лактон как субстрат. Ответственные ферменты были всецело локализованы внутри митохондрий. L-галактоно--лактон быстро превращался в l-АК. Скорость превращения l-гулоно--лактона в l-АК составляла лишь 1/20 от скорости предыдущей реакции.

Таким образом, группой Ф. Ишервуда получены экспериментальные данные в подтверждение того, что в биосинтезе АК могут быть использованы производные d-глюкозы и d-галактозы, причем последние: d-галактуроновая кислота, l-галактоно--лактон - являются лучшими субстратами, чем соответствующие производные d-глюкозы. Этот путь образования АК, по мнению авторов, включает инверсию углеродного скелета исходной молекулы и образование промежуточных фосфорилированных продуктов.

Схема путей биосинтеза l-АК у Euglena gracilis, предложенная С.Шигеока, предусматривает возможность обмена метаболитами, образующимися из d-глюкозы и d-галактозы при перестройке их в молекулу АК.

Эффективным приемом в выяснении путей синтеза АК является использование радиоактивных метчиков, что дает возможность проследить путь от исходного вещества до конечного продукта. Такие исследования с использованием радиоактивных веществ проведены Ф. Ловусом с сотрудниками. В отделенные созревающие плоды земляники вводились растворы гексоз, меченых по определенному атому углерода. Через 24-120 часов из плодов выделялась АК, в ней определялось место меченого углерода и величина его активности. Кроме земляники анализировались листья винограда, петрушки, проростки кресс-салата, молодые побеги фасоли,

Изолированные листья винограда трансформировали d-глюкозу в l-АК с сохранением порядка атомов С-цепочки и С-6-положения оксиметильной группы. В ягодах земляники и побегах фасоли исследовался биосинтез l-АК из l-гулоно-1,4-лактона и l-галактоно-1,4-лактона. Радиоактивность в l-АК была локализована в том же атоме углерода, что и в предшественнике. Результаты некоторых исследований, выполненных Ф.Ловусом с сотрудниками, суммированы в таблице 7.

Из представленных данных видно, что в плодах земляники и проростках кресс-салата молекула глюкозы, меченая по 1,2 или 6-му углеродному атому, превращается в l-АК, меченую соответственно по 1, 2 или 6-му атому углерода. Это дало возможность авторам предполагать, что образованиеl-АК из d-глюкозы и d-галактозы идет без разрыва углеродной цепи и без специфического использования одной или другой триозы. Данный случай рассматривается как один из путей образования АК в растениях, включающий образование фосфорилированных гексоз.

Иная картина была получена, когда в зеленые плоды земляники ввели d_глюкуронолактон, меченый по первому углеродному атому. После 66-часовой экспозиции 97% метки было сосредоточено в 6-м углеродном атоме l-АК, что возможно только при перестройке углеродного скелета.

Подобная инверсия цепи углерода имела место при введении в плоды земляники d-галактуроновой кислоты. Данные эксперименты подтверждают мнение Ф.Ишервуда и его коллег о том, что образование l-АК предусматривает инверсию молекул исходных гексоз. Однако необходимо иметь в виду, что в данном случае образование АК зависело от введения специфического углеродного источника, такого, как d-глюкуронолактон. В нормальном процессе биосинтеза АК этот путь, очевидно, не будет главным.

Таблица 7

Включение субстратов - ¹⁴С в l-АК

Следовательно, в растениях существует и другой путь синтеза l-АК из d-глюкуронолактона и d-галактуроновой кислоты, который не включает образование промежуточных фосфорилированных продуктов и предусматривает образование l-АК с инвертным порядком углерода С-цепочки по сравнению с исходной уроновой кислотой или лактоном.

Предположение о существовании в растениях двух путей синтеза l-АК, выдвинутое Ф. Ловусом и др., встретило возражение со стороны Ф. Ишервуда и Л. Мапсона. Так как экспериментальные доказательства в пользу отсутствия инверсии углеродной цепи глюкозы при образовании АК зависят от чистоты ее изолирования, то можно предположить, что существует радиоактивное загрязнение АК, которое трудно удалить. Таким загрязняющим веществом авторы считают d-арабоаскорбиновую кислоту, которая может быть образована следующим образом: d-глюкоза 6-фосфо-d-глюконовая кислота 3-окси-6-фосфо-d-глюконовая кислота 3-окси-d-глюконовая кислота d_арабоаскорбиновая кислота. Важно отметить, что глюкоза, меченая по первому углеродному атому, даст d-арабоаскорбиновую кислоту, меченую также по первому углеродному атому, так что действительная картина превращения d-глюкозы в l-АК будет завуалирована.

В связи с тем, что в синтезе АК галактоза используется лучше, чем глюкоза, а радиохимические доказательства отсутствия инверсии в отношении галактозы менее определенны, чем в отношении глюкозы, то необходимы дальнейшие работы, чтобы решить вопрос, существуют ли два пути синтезаl-АК в растениях, как предполагает Ф.Ловус, или один путь, включающий инверсию углеродной цепочки d-глюкозы или d-галактозы при образовании l-АК, как считает Ф.Ишервуд и др.

Компартментация процесса биосинтеза аскорбиновой, дегидроаскорбиновой и дикетогулоновой кислот

Внутри растительной клетки АК распределена неравномерно. Содержание ее в субклеточных структурах во многом зависит от их функционального состояния и от внешних условий. Обнаружение АК в тех или иных органоидах еще не дает основания связывать ее биосинтез с данными компартментами, так как между клеточными структурами постоянно идет обмен метаболитами. Поэтому при решении вопроса о внутриклеточной локализации биосинтеза АК в листьях ячменя нами не только учитывались данные по количественному распределению аскорбата, но и исследовалось накопление АК и ее дериватов - ДАК и ДКГК - при ингибировании хлоропластных, митохондриальных и цитоплазматических рибосом в зеленых, этиолированных и альбиносных листьях ячменя.

Содержание АК, ДАК и ДКГК определяли по методу В.В. Соколовского, Л.В. Лебедевой, Т.Б. Лиелуп, приспособленному нами для анализа растительного материала. В качестве ингибитора хлоропластных рибосом использовали стрептомицин, связывающийся с 30S-субъединицами 70S-рибосом. Цитоплазматические рибосомы блокировали циклогексимидом в концентрации 15 мкг/мл, митохондриальные - хлорамфениколом (100 мкг/мл), учитывая, что к нему чувствительны и рибосомы хлоропластов.

Растения, полученные из обработанных СМ семян (альбиносы), имели альбиносное основание, зеленую верхушку и желто-зеленую переходную зону. Анализ содержания АК, ДАК и ДКГК в участках листа с различной пигментацией показал присутствие анализируемых кислот и в альбиносной ткани, где уровень АК и ДАК был несколько ниже, чем в верхней и средней зоне листа, но в большем количестве обнаруживалась окисленная форма АК. Таким образом, альбиносная ткань обладает способностью синтезировать АК и ее производные, несмотря на значительные нарушения структуры некоторых клеточных органоидов.

Правомерно возникает вопрос о возможности транспорта АК из зеленой ткани листа в альбиносную, так как в растениях АК может из листьев передвигаться по проводящим пучкам флоэмы, по центральной полости стебля и по межклетникам паренхимы даже в корни. Исследования, выполненные на листьях хлорофитума с различным содержанием белой ткани, показали, что в срезанных листьях не происходит переброса меченых ассимилятов из зеленой ткани в белую ни на свету, ни в темноте, хотя стоит учесть, что характер расположения белых зон у хлорофитума и у частично альбиносных листьев ячменя различный.

С целью изучения компартментации процесса биосинтеза АК исследовалось накопление ее в одновозрастных зеленых, этиолированных и альбиносных проростках ячменя. В опытах использовались не целые листья, а лишь нижние их участки, по размеру соответствующие альбиносной зоне мутантных листьев. Длительное выдерживание зеленых проростков ячменя в темноте снижало в них уровень АК, а последующее освещение стимулировало ее накопление. Этюд определялась постановка наших опытов, в которых масштаб светозависимого накопления АК определялся в проростках, отличающихся по степени сформированности фотосинтетического аппарата после длительного выдерживання их в темноте. После 48-часовой темновой экспозиции проростки значительно отличались по содержанию восстановленной формы АК: максимальное количество аскорбата обнаружено в этиолированных проростках, минимальное - у альбиносных, зеленые проростки содержали лишь 62% АК от уровня ее в этиолянтах.

Последующее освещение в течение 24 часов увеличило количество АК во всех типах проростков, но масштаб светозависимого накопления аскорбата был неодинаков; если у зеленых проростков произошло удвоение содержания АК, то у альбиносов и этиолированных проростков прирост АК составил лишь 36 и 19% соответственно.

Следовательно, проростки, отличающиеся по пигментному составу и по степени сформированности фотосинтетического аппатара, обладают разной способностью накапливать АК. Пул АК на свету определяется новообразованием и одновременно идущими процессами ее использования, в которых восстановленная форма АК обратимо окисляется до дегидроаскорбиновой кислоты, а разрыв лактонового кольца в последней приводит к необратимому образованию дикетогулоновой кислоты.

Одновременный анализ указанных кислот показывает направленность процессов в системе АК ДАК ДКГК. Так, в зеленых проростках на свету уменьшается уровень ДАК при одновременном возрастании количества ДКГК, тогда как у этиолированных проростков сумма дериватов не меняется и остается на более низком уровне, чем в пигментированных листьях. В связи с этим можно полагать, что у зеленых проростков на свету восстановленная форма АК используется активнее, чем у этиолированных и, следовательно, действительный уровень светозависимого биосинтеза АК в зеленых проростках выше определяемого. Следует отметить, что если у этиолированных проростков на свету количество ДАК увеличивается, то у зеленых уменьшается, что, вероятно, происходит за счет фотовосстановления ДАК до АК, которое имеет место в хлоропластах.

Таким образом, учитывая структурные и физиологические различия зеленых, этиолированных и альбиносных проростков и их способность синтезировать АК на свету, можно было бы связывать биосинтез аскорбата с хлоропластами и, вероятно, с процессом фотосинтеза. Но, как показали проведенные опыты, АК накапливается в больших количествах в этиолированных проростках в темноте, а светозависимый биосинтез ее идет и у альбиносных проростков при увеличивающемся использовании АК на свету, так как в этих условиях нарастало количество продуктов окисления АК - ДАК и ДКГК. Альбиносные проростки были получены из семян, обработанных стрептомицином, который взаимодействует с 30S-субъединицами 70S-рибосом. Следовательно, светозависимое накопление АК может идти при ингибировании хлоропластных рибосом, и можно предположить, что ферменты, участвующие в метаболизации углеводов до АК, синтезируются без участия данных структур.

В последующих опытах выяснялось влияние ингибирования митохондриальных рибосом на биосинтез АК, так как ранее при исследовании количественной локализации АК в листьях ячменя было показано светозависимое накопление АК во фракции, включающей митохондрии. Ингибирование митохондриальных рибосом осуществлялось хлорамфениколом (100 мкг/мл), к которому чувствительны и рибосомы хлоропластов. В опытах использовались зеленые и альбиносные проростки, выдержанные 48 часов в темноте. Нижние участки листьев данных проростков, а также этиолированных вырезались и помещались основанием в воду (контроль) или раствор хлорамфеникола на свет.

У контрольных зеленых проростков на свету количество АК увеличилось на 134%, ДКГК - почти вдвое. В присутствии хлорамфеникола уровень светозависимого накопления АК и ДКГК понизился с одновременным возрастанием содержания окисленной формы. В этиолированных проростках, также как и у зеленых, в присутствии хлорамфеникола на свету синтез АК тормозился, и только у альбиносов светозависимое наколение АК не ингибировалось хлорамфениколом. Таким образом, в присутствии хлорамфеникола светозависимое накопление восстановленной формы АК снижалось у этиолированных и зеленых проростков и не менялось у альбиносных.

Хлорамфеникол оказывает ингибирующее действие на 80S-рибосомы митохондрий, но известно его влияние и на синтез белков хлоропластов, преимущественно высокомолекулярных. Поэтому снижение уровня АК у зеленых и этиолированных проростков в присутстсвии хлорамфеникола может быть результатом действия его на оба типа рибосом. У альбиносных проростков на свету масштаб накопления АК в присутствии хлорамфеникола не менялся, и это дает основание считать, что синтез ферментов, участвующих в метаболизации углеводов до АК, может идти без участия не только хлоропластных рибосом, но и митохондриальных.

Светозависимое накопление АК, блокируемое хлорамфениколом,в зеленых проростках составило 35% от всей синтезированной на свету АК, в этиолированных - 54. Следовательно, как минимум половина АК листьев ячменя синтезировалась в присутствии ингибитора хлоропластных и митохондриальных рибосом. Разницу в масштабе ингибирования светового синтеза АК в зеленых и этиолированных проростках хлорамфениколом можно объяснить, допустив, что фотовосстановление ДАК в хлоропластах - чисто фотохимический процесс, идущий без участия ферментов, хотя восстановление ДАК до АК возможно с помощью дегидроаскорбатредуктазы. Скорее всего, эти проростки отличаются разной скоростью использования АК на свету и неодинаковой обеспеченностью субстратом процесса биосинтеза АК.

Рибосомы митохондрий высших растений по седиментационным свойствам и плотностной характеристике не отличаются от 80S-рибосом, но отношение к ингибиторам белкового синтеза у них иное, чем у цитоплазматических, имеющих константу седиментации тоже 80S: если митохондриальные рибосомы ингибируются хлорамфениколом, то цитоплазматические - цикдогексимидом, угнетающим синтез белка. Действие циклогексимида на светозависимое накопление АК проверялось в следующих опытах.

Уровень АК в проростках ячменя подвержен сезонным колебаниям: зимой он выше, летом ниже. В данных опытах использовались зеленые проростки с низким содержанием АК, чему способствовало и предварительное выдерживание их в темноте в течение 24 часов. Такие проростки обычно активно накапливают на свету аскорбат. В условиях опыта часть проростков после темноты освещалась на воде (контроль), другая - на растворе циклогексимида. В контрольном варианте уровень АК повысился более чем в 3 раза, в присутствии же циклогексимида светозависимое накопление АК было полностью блокировано. Следовательно, в процессе биосинтеза АК в растениях на свету принимают участие ферменты, биосинтез которых идет на 80S-рибосомах цитоплазмы.

Как говорилось выше, АК в растениях может синтезироваться из глюкозы и (с большей скоростью) из галактозы, но путь этого синтеза окончательно не изучен. В общем виде он представляется следующим образом: d-галактоза d_галактуроновая кислота l-галактоновая кислота l-галактоно--лактонl_аскорбиновая кислота. По данным, восстановление метил-d-галактуроната в l-галактоно--лактон в системе in vitro идет при участии фермента, локализованного в растворимой части цитоплазмы, а окисление лактона в l-АК требует ферментного комплекса или одного фермента, заключенного в митохондриях. В случае использования в качестве субстрата при биосинтезе АК глюкозы этими ферментами будут глюкуронатредуктаза и гулонолактоноксидаза соответственно. Для второго фермента показано, что в митохондриях эвглены его содержание составляет только 11,6% от общего количества, а больная часть (86,7%) обнаруживается в цитозоле.

Учитывая полученные данные по полному ингибированию биосинтеза аскорбиновой кислоты циклогексимидом, можно полагать, что биосинтез глюкуронатредуктазы идет на 80S-рибосомах. Возможно, и биосинтез гулонолактоноксидазы связан с цитоплазматическими рибосомами, если же она синтезируется на митохондриальных рибосомах, то блокирование синтеза АК в этом случае обусловлено отсутствием субстрата для фермента-l-гулонолактона.

В работе показано, что при длительном освещении проростков ячменя значительно увеличивается количество АК во фракции, содержащей митохондрии, тогда как во фракции хлоропластов содержание аскорбата уменьшается (или не меняется) при 10-минутной экспозиции, а в темноте - наоборот. Эти факты могут говорить об активном использовании АК в митохондриях в процессе дыхания и в хлоропластах в процессе фотосинтеза, поэтому при отсутствии в темноте фотосинтеза АК накапливается в хлоропластах, а на свету, когда в зрелых тканях ячменя с хорошо сформированным фотосинтетическим аппаратом понижается темновое дыхание, количество АК увеличивается в митохондриях.

Накопление АК в митохондриях на свету может быть и результатом субстратной стимуляции новообразования аскорбата. Однако показано, что экзогенный субстрат - глюкоза - в темноте не стимулирует синтез АК. Если же предположить, что в биосинтезе АК лучше используются "молодые" продукты фотосинтеза или восстановитель - НАДРН+Н⁺ фотосинтетического происхождения, тогда становится понятным факт более активного накопления АК в зеленых проростках на свету по сравнению с этиолированными и альбиносными.

Таким образом, масштаб светозависимого накопления восстановленной формы АК в проростках ячменя определяется степенью сформированности хлоропластов и является максимальным у зеленых проростков по сравнению с этиолированными и альбиносными. Пополнение пула АК на свету тормозится в присутствии хлорамфеникола у всех типов проростков, кроме альбиносных. У зеленых растений светозависимое накопление АК полностью ингибировалось циклогексимидом, что говорит об участии цитоплазматических 80S-рибосом в биосинтезе ферментов, принимающих участие в метаболизации углеводов в l-АК.

С текущей ситуацией и прогнозом развития российского рынка продуктов глубокой переработки пшеницы можно познакомиться в отчете Академии Конъюнктуры Промышленных Рынков «Рынок продуктов глубокой переработки пшеницы в России».

Список использованной литературы:

1. Роговин В.В., Муравьев Р.А., Акимов Б.С. и др. // Физиология раст. 1987. Т.34. №6. С. 1181-1186.

2. Симонова Е.И. // Физиология растений. 1987. Т. 34. № 4. С.758-764.

3. Читанова Г.В. // Тр. Сухум. ботан. сада. 1982. № 27. С. 49-56.

4. Чупахина Г.Н. // Тез. Всесоюз. симпозиума "Связь метаболизма углерода и азота при фотосинтезе". Пущино, 1985. С. 88-89.

5. 174. Чупахина Г.Н., Немирюк Л.В. // Физиология

6. Явигиев Б.Г. Автоматизированный анализ колебательных процессов, возникающих в растениях при колебательном возбуждении их светом. // Биофизика. М., 1987. 31 с. Деп. в ВИНИТИ 12.06.87., № 4292-В87.

7. Aliotta G. // G. bot. ital. 1980. Vol. 114. N 5. P. 217-226.

Chameldes W.Z. // Enviren. Sci. and Technol. 1989. Vol. 23. N 5. P. 595-600.

8. Spethmann W. Herkunftsforschung bei Straucharten - Beispiele zeigen Unterschiede Deutsche Baumschule / W. Spethmann. 2003. 55 (3):28-29.

9. Kulaeva O.N., Karavaiko, N.N., Selivankina, S.Y., Moshkov, I.E., Novikova, G.V., Zemlyachenko, Y.V., Shipilova, S.V. and Qrudgev, E.M. 1996. Cytokinin signalling systems. Plant Growth Regulation 18, 29-37.